高尿酸血症实验动物模型研究进展

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是一种遍及全球的代谢性疾病，全球发病率为5%~25%[1]，我国发病率估计已超过10%[2]，且随着生活水平的不断提高，高热量、高脂肪、高蛋白摄入量增加，HUA患病率呈现上升和年轻化趋势。HUA已经成为高血压、高血脂、高血糖“三高”之后的第四高，严重危害人类健康。尿酸是人体内的正常代谢产物，血清中含量男性为149~416 μmol·L-1，女性为89~357 μmol·L-1。目前HUA的临床检验标准为：在正常饮食情况下，两次不同日空腹检测血清尿酸水平男性>416.0 μmol·L-1，女性>356.9 μmol·L-1[3]。临床上一般将HUA分为原发性HUA和继发性HUA，原发性HUA是由于先天性嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所引起，继发性HUA是由于疾病、药物治疗或饮食摄入不均衡引起。HUA易引起痛风、肾损伤，并与糖尿病、高血压、心血管等疾病有密切关系，且病情易反复发作。

HUA已经成为危害人民健康的常见病理表现，研究HUA的发病机制和防治药物是医药科学发展的重要任务。人类在进化过程中失去了尿酸酶，尿酸成为人类嘌呤类物质的最终代谢产物。而在常用的实验动物体内，依然保持着尿酸酶，可以直接将尿酸代谢为尿囊素而排泄。因此，常用实验动物一般不会出现HUA，这也是制备HUA实验动物模型的难点所在。目前，现有的HUA模型理论和技术趋于成熟，已在啮齿类，灵长类，禽类，鸟类和鱼类等机体上成功构建HUA模型，并根据HUA病理机制不同构建出不同类型的HUA模型，但存在模型不稳定、死亡率高、并发症严重、个体差异大等缺点，因此，建立稳定且能够反映临床病理特征的HUA动物模型具有重要意义。

尿酸是一种弱有机酸，体内尿酸来源主要分为两种，一种是外源性即饮食摄取，约占总尿酸来源的20%；另一种由机体内的核酸等代谢分解而来，约占总尿酸的80%[4]。尿酸是人类嘌呤代谢的最终氧化产物，生成途径为腺嘌呤和鸟嘌呤经去氨基、去磷酸化分别形成肌苷和鸟苷，在酶的作用下分别生成次黄嘌呤和鸟嘌呤，又在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为黄嘌呤，进一步转化为尿酸[5]

尿酸的代谢途径主要分为肠道排泄和肾脏排泄，其中肠道排泄占25%，与尿酸转运蛋白和肠道菌群有关[6]。体内75%的尿酸经过肾脏排泄，但尿酸在经肾小球过滤后，约有90%被肾小管重吸收，少部分经肾小管排出体外[7]。尿酸转运蛋白参与尿酸排泄，通过对尿酸的分泌和肾小管重吸收的精细调控，调节体内尿酸浓度的动态平衡。

正常机体内，尿酸的生成与排泄处于动态平衡，当平衡被打破，尿酸在体内浓度过高时，引发HUA。HUA使尿酸过饱和，以尿酸钠盐的形式形成结晶，沉淀在关节、滑膜、肾小管等处，引起痛风性关节炎、肾结石等疾病。HUA会增加急性肾损伤的风险，对肾小管上皮细胞造成伤害，长期如此，会引起慢性肾病。肾功能受损后，肾小球过滤等功能下降，尿酸排泄减少，导致尿酸浓度持续升高。临床上，90%的HUA患者是由于肾脏排泄能力下降所致[8]。

在评价模型是否成功，研究药效和机制等方面，检测指标和检测技术都至关重要，往往影响着实验结果。

尿酸是嘌呤代谢的终产物，是评价HUA模型的核心指标，采用磷钨酸还原法检测尿酸水平，在碱性环境中无蛋白滤液尿酸还原磷钨酸生成钨兰，钨兰的生成量与尿酸含量成正比，通过比色测定尿酸水平。肌酐(creatinine，Cr)是肌肉代谢的产物，由肾小球滤过排出，是评价肾脏滤过、重吸收能力的生化指标，采用苦味酸法检测Cr水平，碱性条件下，Cr与苦味酸产生Jaffe反应，生成黄色复合物，进行比色测定Cr水平。肾脏功能和肝脏功能也是HUA模型中不可忽视的评价指标，它们既能评价造模程度，也能评价药物对疾病的治疗效果和对机体的副作用。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)是人体蛋白质代谢的主要终末产物，从肾小球滤过后排出体外，当肾功能受损时，血液中BUN升高，是评价肾小球滤过功能的指标，采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法检测尿素氮。丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)是评价肝功能水平的常见指标，通常采用底物法检测。HUA与血糖血脂关系密切，总胆固醇(cholesterin，CHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)和血糖等也是常见的检测指标。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)直接催化黄嘌呤生成尿酸，其活性对尿酸生成有着重要影响，是评价肝功能的常用指标，XOD主要分布在肝脏，当肝功能受损时，XOD大量释放到血清中，采用黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒测定。肾脏离子转运体URAT1、OAT1、OAT2、OAT3、ABCG2，肠道转运体GLUT2、GLUT5、GLUT9等均参与尿酸调控，通常检测其mRNA水平和蛋白表达水平。丙二醛(malonaldehyde，MDA)是自由基发生氧化反应的最终氧化产物，含量反映机体或组织氧化水平，MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，532 nm有最大吸收峰。肝肾脏通过HE染色制成石蜡切片，观察肾小球体积变化、内皮细胞、炎性细胞、肾小管内蛋白质变化等评价肝肾损伤程度。目前，评价HUA模型的指标和技术较为全面，但尚无统一的评价标准，理想的HUA模型应具备以下特点：(1)尿酸升高迅速；(2) HUA状态稳定；(3)减少非尿酸所致的组织病变；(4)HUA模型可复制。

根据HUA的形成机制，制备HUA动物模型主要有五种方法：①增加尿酸来源；②抑制尿酸排泄；③抑制尿酸代谢；④综合因素；⑤基因改造型。

通过对实验动物直接补充尿酸或补充尿酸前体物质制备HUA模型，如腺嘌呤、次黄嘌呤等，腺嘌呤是一种含氮杂环类嘌呤，机体摄入大量的腺嘌呤后，磷酸核糖焦磷酸与谷酰胺的水平显著增加，黄嘌呤氧化酶活性增加，加快尿酸的合成，从而提高血尿酸含量；次黄嘌呤是尿酸生成的直接前体物质，经酶分解转化成尿酸，短时间内尿酸大量产生，机体不能及时将尿酸转化为尿囊素，血液中尿酸水平显著升高。

实验动物给予大剂量的酵母、果糖等食物也可升高尿酸水平。酵母富含蛋白质，分解产生大量嘌呤碱和嘧啶碱，引起嘌呤代谢紊乱，从而促进尿酸的产生。果糖磷酸化分解需要消耗三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，ATP进一步分解成腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)，AMP激活嘌呤代谢酶系统，被分解为尿酸。

给小鼠腹腔注射尿酸(0.125 ~ 0.5 g·kg-1)，制备急性HUA模型。以0.25 g·kg-1注射剂量造模效果最好，在注射10 min后血尿酸水平最高，维持4 h以上。性别对该模型小鼠血清尿酸水平无影响，老年小鼠比青年小鼠更易构建HUA模型[9]。腹腔注射尿酸(0.15 g·kg-1)3次诱导形成HUA小鼠，与对照组相比，模型组尿酸值升高2.7倍，URAT1和GLUT9基因表达水平无变化，蛋白表达显著升高[10]。

小鼠一次性腹腔注射给予次黄嘌呤(0.1 ~ 1 g·kg-1)造模，2 h、4 h、8 h测血清尿酸，尿酸浓度值显著升高。一次性腹腔注射0.1 g·kg-1次黄嘌呤，0.5 h尿酸达到峰值680.75±112.78 μmol·L-1，4 h降到峰值一半，24 h后模型组尿酸仍显著高于对照组[11]。小鼠一次性腹腔注射次黄嘌呤(0.1 g·kg-1)，45 min后测得模型组尿酸水平为对照组的3.8倍，XOD活力、URAT1的mRNA表达水平显著升高，但BUN、Cr、ALT和AST无显著差异[12]。

用含有腺嘌呤的饲料(1 ~4 g·kg-1)喂养大鼠，d 7中、高剂量组(2，4 g·kg-1)尿酸显著升高并到达峰值，随着持续给予腺嘌呤，血清尿酸浓度逐渐下降。d 14中、高剂量组肾间质被炎性细胞浸润，肾小管扩张，出现针状结晶，表明出现肾损伤[13]。大鼠连续3周灌胃给予腺嘌呤(0.075 g·kg-1)，每周尾静脉取血，测尿酸、BUN、TG、Cr和MDA水平。造模1周后，模型组血清尿酸升高26.8%，造模3周后，尿酸升高43.3%，XOD活性显著下降，肾脏系数升高27.5%，BUN升高111.5%，Cr升高41.7%，MDA升高39.3%[14]。

连续用酵母膏(0~60 g·kg-1)灌胃给药，研究不同剂量酵母膏造模对小鼠尿酸水平的影响，高剂量组给药d 3小鼠出现死亡，d 4死亡一半，其余组小鼠尿酸水平显著升高，且存在量效关系；用0~30 g·kg-1酵母膏连续灌胃给药4周，第1周尿酸水平显著性升高，停药3 d后继续给药，尿酸水平下降，可能与肾脏排泄能力增强有关[15]。连续14 d灌胃给予酵母膏(20 g·kg-1)造模，与空白对照组相比，模型组小鼠血清尿酸、XOD和BUN水平显著增高，但Cr水平无显著差异[16]。

10%的果糖饮用水，大鼠连续饮用8周，模型组尿酸水平升高45.4%，XOD活性升高65.7%，十二指肠GLUT2、GLUT5蛋白表达水平显著升高[17]。大鼠连续给予10%果糖水，d 20起，模型组尿酸水平显著升高，肝脏XOD活性亦显著升高，但尿酸水平，尿酸清除率无差异，果糖转运体GLUT9的mRNA表达水平无显著差异[18]。

一次性直接补充尿酸或尿酸前体物质，可以快速升高尿酸水平，是较为简单快捷的方法，但不能够长期维持，若长期给药，又造成严重的并发症，如长期给药腺嘌呤可制备肾衰竭模型。通过长期给予酵母膏和果糖饮用水等诱导尿酸升高，模型较稳定，但由于无法控制每个实验动物的饮食饮水量，造成尿酸水平个体差异大，且浪费大。

尿酸主要通过肾脏排泄，肾小管上分布大量尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白，通过抑制肾脏的排泄功能，增强尿酸重吸收、减少尿酸分泌，使尿酸在体内聚集，机体尿酸水平升高，造成HUA。常用的造模剂有乙胺丁醇，烟酸等，乙胺丁醇是一种抑菌性抗结核药物，可竞争性抑制近端小管中的尿酸分泌引起血清尿酸升高，维生素C属于酸性物质，当大剂量使用时，可使尿中草酸盐的含量增加10倍以上，对尿酸的正常代谢造成影响，从而引起HUA。烟酸即维生素B3，在人体内转化为烟酰胺，参与体内脂质代谢、组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程，既能增加尿酸的产生，也能降低其清除率，对尿酸的升高成剂量依赖性。

腺嘌呤(10 g·L-1)加乙胺丁醇(25 g·L-1)连续21 d大鼠灌胃给药。造模第1周，模型组出现脱毛，活动减少等现象，第3周，体质量相比对照组明显下降，尿酸、Cr和BUN水平显著升高，肾小球体积增大，出现空泡样，肾小管蛋白质渗出[19]。次黄嘌呤(0.624 g·kg-1)加烟酸(0.102 g·kg-1)连续15 d大鼠灌胃给药，模型组尿酸水平为(179.2±14.72) μmol·L-1，Cr水平为(46.6±10.02) μmol·L-1，BUN水平为(7.9±0.45) μmol·L-1，显著高于对照组[20]。

乙胺丁醇用于抗肺结核，烟酸是人体必需维生素，它们作为药物被患者服用，此类模型可用于模拟由于药物减少或抑制尿酸排出导致的HUA。联合氧嗪酸钾造模，能长时间维持高尿酸水平，但停药后，尿酸水平会立刻下降。

尿酸酶存在于啮齿类动物体内，尿酸可通过尿酸酶代谢为尿囊素排出体外，因此抑制尿酸酶可抑制尿酸排泄，从而升高尿酸水平。氧嗪酸钾为三氮杂苯类化合物，其结构与尿酸的嘌呤环相似，能选择性抑制尿酸酶活性，是常用的HUA动物模型造模剂。

大鼠一次性腹腔注射氧嗪酸钾(0.1~0.6 g·kg-1)制备急性HUA模型。结果显示给药1 h后血清尿酸逐渐升高，2 h达到顶点值，0.3 g·kg-1剂量组大鼠血清尿酸值可升至403.8 μmol·L-1，并能维持4 h [21]。分别用5%果糖水加0.1 g·kg-1氧嗪酸钾，5%果糖水和0.1 g·kg-1氧嗪酸钾三种造模方式，连续18周大鼠皮下注射给药。第1周，联合给药组血清尿酸显著升高，第2周开始，两个单一给药组血清尿酸也显著升高，至第4周，与正常组相比，差异消失，联合给药组持续存在差异，尿酸水平维持在300 μmol·L-1，整个实验期间动物身体精神状况健康[22]。

氧嗪酸钾作为尿酸酶抑制剂，可以排除尿酸酶的干扰，模拟人类内无尿酸酶。单独给药能在短时间内造成HUA模型，但排泄快，单独使用无法长期造模，常采用联合给药方式。

增加尿酸生成的同时，减少尿酸的排泄，此类多重因素影响下的造模方式，比单一给药造模方式更稳定，尿酸水平升高更显著。如给予氧嗪酸钾的同时，再给予尿酸前体物质或富含嘌呤食物。

分别用酵母(30 g·kg-1)、次黄嘌呤(1 g·kg-1)、氧嗪酸钾(0.25 g·kg-1)、腺嘌呤(0.1 g·kg-1)加乙胺丁醇(0.25 g·kg-1)4种造模方式，连续14 d灌胃给药，模型组尿酸值均显著升高，其中以氧嗪酸钾造模效果最显著，升高108%[23]。用次黄嘌呤(0.3 g·kg-1)加氧嗪酸钾(0.25 g·kg-1)、次黄嘌呤(0.3 g·kg-1)加氧嗪酸钾(0.75 g·kg-1)、次黄嘌呤(0.5 g·kg-1)加氧嗪酸钾(1 g·kg-1)、氧嗪酸钾(1.5 g·kg-1)共4个模型组，小鼠连续7 d灌胃给药，探究出最佳造模剂量为次黄嘌呤(0.5 g·kg-1)加氧嗪酸钾(1 g·kg-1)，但该组小鼠造模期间出现饮食及活动减少[24]。

在大小鼠尿酸排泄过程中，尿酸被尿酸酶氧化分解为尿囊素排出体外，通过敲除尿酸酶基因，可抑制尿酸的转化，从而升高尿酸水平。在肾脏排泄途径中，肾小管起分泌尿酸作用，通过敲除参与尿酸分泌的肾小管转运体蛋白基因，抑制肾小管的尿酸分泌，可升高尿酸水平[25]。

Wu等[26]在胚胎干细胞中通过同源重组敲除小鼠的氧化酶基因，构建一种HUA小鼠模型。150只纯合突变小鼠有97只在出生4周内死亡，死亡率达到65%。纯合突变小鼠血清尿酸是野生型和杂合型的10倍，但过早出现肾脏损坏，在出生6 d后，肾脏出现皮质囊肿和沉积物，8 d后观察到肾小管再生和扩张，第五周出现严重的肾积水。通过腹腔注射给予别嘌醇(150 g·L-1)治疗，纯合突变体小鼠血清尿酸降低约50%，存活率提高31.1%。

Takada等[27]在研究小鼠ABCG2基因敲除对尿酸排泄途径的影响时发现，该基因对尿酸肠道排泄途径影响较大，对肾脏排泄途径无影响，尿酸水平升高不明显，联合氧嗪酸钾造模可以获得较好的效果。

合适的实验模型是研究疾病的病理机制和研发相应治疗药物的基础。不同的动物模型具有各自的特点，选择适合研究的模型至关重要。目前，HUA模型所用的实验动物主要有啮齿类、禽类，亦有研究人员选用灵长类动物和斑马鱼作为模型动物。常用的给药方式有灌胃、腹腔注射和饲喂等。

啮齿类动物HUA模型：啮齿类动物属哺乳动物，在种属上与人相近，是最常用的实验动物，成本低，管理方便。但在复制HUA模型时，因动物体内存在尿酸酶，与人的患病机制存在很大差别，因此常用氧嗪酸钾与其他造模剂联合给药造模，以消除尿酸酶的差异。大鼠常用SD大鼠和Wistar大鼠，小鼠常用昆明小鼠和C57BL/6小鼠。

禽类动物HUA模型：禽类动物体内不含尿酸酶，尿酸是最终产物，因此会发生禽痛风，鸡、火鸡、水禽、雉、鸽子等都可发生痛风。在一些鸡场常发生禽痛风，死亡率高达30%[28]。禽类嘌呤代谢途径与人相似，但因种属差异太大，且饲养不方便，故选用此类动物的较少。

其它动物HUA模型：灵长类动物与人同源，在尿酸代谢途径上与人一样，是最优的模型动物，但成本高昂。Tang等[29]将Cr(0.075~0.2 g·kg-1)腹腔注射于恒河猴体内，30 min后，血清尿酸值从0 h的(51.77±14.48) μmol·L-1升高至(178.32±14.47) μmol·L-1，1 h达到峰值(201.41±42.73) μmol·L-1，成功建立急性HUA模型。Zhang等[30]选用氧嗪酸钾(200~400 μmol·L-1)和黄嘌呤(10~20 μmol·L-1)联合浸泡孵化后5 d的斑马鱼幼鱼，成功构建HUA急性模型，以别嘌醇作为阳性药物验证模型，为大量筛选降尿酸药物提供了一种新思路。

近年来，研究者对HUA动物模型的建立做出了很多创新和探索，建立了各种不同机理的HUA模型，以期满足临床上HUA患者，但依然存在一定差距和各种问题。一是缺乏统一的造模评价标准，二是动物模型与人类患病机理存在差距。评价一个模型是否制备成功，需要测定各项指标是否满足模型标准，目前尚无认可的、统一的评价指标。大多由研究者自主评价，依靠统计学对比模型组与空白对照组是否有差异，若有差异，则认为造模成功，但无确切的差异标准。且评价模型时，指标选取单一，不够全面，大部分仅仅考察尿酸和肌酐水平。人类HUA 80%为多基因遗传病，受遗传因素影响，与环境和生活方式相关，发病机制复杂。实验模型则发病原因单一，不能完全模仿人类发病机制。文章中所总结的造模类型，也仅仅是从五种单一的发病机制来构建模型，若要建立一种复杂的模型，则在动物身上无法承受，造模引发的严重并发症导致实验动物死亡。动物造模后往往会出现不同程度的肾脏损伤，这种损伤是由HUA导致的并发症还是造模剂的副作用还需进一步考察。性别对造模的影响也无统一结论，有研究发现雌鼠的尿酸波动大，但也有研究发现性别对HUA造模无影响，性别因素还需进一步研究。现阶段常用的实验动物以大鼠为主，造模方法多采用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾加尿酸前体物等联合给药，这类方法较稳定，能长期实验，对动物机体损害小。但人类的病情远比动物模型复杂，寻找到科学、稳定、可重复性高的造摸方法, 是我们不断追求的目标。